| 產品編號 | MFH002 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 英文名稱 | Human TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17 Cytokine Kit (Flow Cytometry Multiplex Bead Assay) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 中文名稱 | 人十項細胞因子檢測試劑盒（流式熒光發光法） | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 克 隆 號 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 性 狀 | Lyophilized or Liquid | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 保存條件 | 2～8℃，避光保存，有效期18個月。開瓶后避光2～8℃保存，可保存不超過30天。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 注意事項 | This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 產品介紹 |
產品介紹 本試劑盒采用CBA多因子流式檢測技術，微球熒光編碼不同，不同微球群上包被TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17特異性抗體，與待測樣本孵育，可與樣本中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17特異性結合，之后加入生物素標記的檢測抗體，形成抗體包被微球-細胞因子-檢測抗體的免疫復合物；最后加入藻紅蛋白標記的鏈霉親和素，與生物素結合，通過流式細胞儀檢測，獲得待測物的熒光強度，熒光強度與樣本中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17的含量成正比，最后結合這十種細胞因子標準品的標準曲線，從而實現對同一份樣本中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17的定量檢測。從而輔助判斷機體的免疫功能狀態。 預期用途 檢測人體血清血漿和培養上清中TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17的表達水平。 試劑盒組成
注：試劑盒中不包括，但試驗需要的材料：流式管， 15 mL 離心管， 1. 5 mL EP 管，錫箔紙，磁力板。 適用機型：本品適用于市面上的大多數有PE和APC通道的流式細胞儀。 樣本要求： 血清、血漿、細胞培養上清：建議4-6小時內檢測，如無法及時檢測請-20℃凍存，忌反復凍融。 檢驗方法 1. 洗液緩沖液（1×)的準備 顛倒混合標有20×洗液的瓶子。在475 mL蒸餾水中加入20×洗液25 mL，并輕輕混合以免起泡沫。儲存于2～8℃待用。 2. 標準品制備（準備8個1.5 mLEP管分別編號1.2.3.4.5.6.7.8 ） 2.1使用前按照下表將各因子的標準品用標準稀釋液溶解，充分混勻，室溫放置10分鐘，分別從每管中取出20 μl混合，此管將被用作標準品最高濃度1號管（5000pg/ml）。
2.2 其他7個（2～8 號）EP管中分別加入150 μL標準品/樣品稀釋液，準備梯度稀釋標準品。 2.3 在1號管中轉移50 μL標準品到2號管充分混勻，再在2號管轉移50 μL到3號管充分混勻。以同樣方式依次連續稀釋到7號管。
3. 捕獲微球預處理 確定實驗孔數（包括標準品和樣本），計算所需捕獲微球混合液的用量。例如：待測樣本88個，標準品8個, 共計96孔。每個孔需要捕獲微球混合液50 μL。我們可以按100孔的量進行微球混合，需取5000 μL捕獲微球混合液。（注意：需將捕獲微球渦旋20 s，充分混勻后再取） 4. 樣本處理 建議對于血清或血漿樣本需使用標準品/樣品稀釋液進行2倍稀釋。 表1
5. 操作步驟 *實驗前將所有試劑取出平衡至室溫； *實驗過程中，包括清洗步驟，將板子始終水平放置，以免珠子丟失； *孵育過程中，板子應注意避光。 5.1 從梯度稀釋好的標準品1-8號管中分別取出50 μL移入對應的96孔板孔中。 5.2 其余樣本孔每孔加入稀釋好的血清或血漿樣本50 μL。 5.3 渦旋微球20 s，每孔加入50 μL微球，現每孔體積應為100 μL/孔。（加微球過程中應隨時渦旋微球管，避免微球沉降，建議每加1-8個孔，渦旋混勻一次微球）。 5.4 將96孔板用封板膜封上，放到搖床上450 rpm/min混勻5min，然后放到37℃, 孵育30min。 5.5 將96孔板卡在磁力板上5 min，去除上清。 5.6 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入200μL洗液。再將96孔板放在磁力板上5 min，去除上清。 5.7 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100μL檢測抗體。 5.8 將96孔板用封板膜封上，放到搖床上450 rpm/min混勻5min，然后放到37℃, 孵育30min。 5.9 重復步驟5.5-5.6。 5. 10 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100μL藻紅蛋白標記的鏈霉親和素。 5. 11 將96孔板用封板膜封上，放到搖床上450 rpm/min混勻5min，然后放到37℃, 孵育15min。 5. 12 重復步驟5.5-5.6。 5. 13 每孔加入200μL洗液重懸樣本，上流式細胞儀檢測。 6. 流式細胞儀檢測 6.1 微球群分布 ： 表2
注：微球內部用不同強度的熒光染料染色。 6.2 模板建立： 建立X軸為FSC、Y 軸為SSC的線性散點圖模板，設定混合微球位置，如說明書圖1； 建議兩個PE（X軸）和APC的對數散點圖模板，分別顯示R1門或R2門內微球，使得所有的微球群能夠清楚和明顯的分布于散點圖上，顯示各因子PE熒光強度。如說明書圖2，圖3。調節PE PMT電壓，使所有微球群左側不壓線，右側位于PE軸檢測范圍內（說明書圖2,3）。 6.3 樣品的檢測結果分析 各標準品及樣本依次上機檢測，對于每種微球群，應最少獲取100個微球。利用標準品梯度作標曲，計算樣本檢測結果。 7. 軟件分析 用FCAP軟件進行分析 參考區間 用十項細胞因子檢測試劑盒(流式熒光發光法)檢測150例健康者，得到正常參考值：IL-1β ≤3.4 pg/mL、IL-2≤11.4 pg/mL、 IL-4≤12.9 pg/mL、 IL-6≤20 . 1 pg/mL 、 IL-8≤15.71 pg/mL 、 IL-10≤5.9 pg/mL、 IFN-γ≤15. 1 pg/mL、TNF-α≤6 . 1 pg/mL、IL-12p70≤10. 18 pg/mL、IL-17≤ 8. 57pg/mL（由于環境、性別、年齡等差異，此數據僅供參考）。 檢測結果的解釋 1. 待檢測樣本細胞因子的測定在表3檢測范圍內，測定結果有效，可直接報告測定結果；若檢測結果超出檢測范圍,應用標準品/樣品/微球稀釋液將樣本稀釋適當的倍數重新檢測；若待測樣本的檢測結果低于檢測下限或未檢測到，則直接報告為≤最低檢測值。 表3
2. 建議：負責數據揭示和出具報告的實驗人員需經過正規的技術培訓。 檢驗方法的局限性 不合理的樣本采集、轉運、儲存、處理以及儀器的設置不當均有可能導致錯誤的檢測結果。 產品性能指標 1. 外觀和性狀 試劑盒各組份應齊全、完整，液體無滲漏；外包裝應完整、無破損，標簽應清晰、易識別。 2. 裝量 應符合要求，不低于標示值。 3. 準確度 使用本試劑盒檢測已知濃度的樣本，其檢測結果相對偏差在±15%以內。 4. 重復性 本試劑盒檢測TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17變異系數（CV）應≤15%。 注意事項 1. 本試劑盒僅用于科研，不用于臨床診斷。 2. 實驗樣本、質控/標準品、實驗廢棄物等材料應當作為潛在傳染物進行處理，并且采用符合法規的預防措施對其處理。 3. 流式細胞儀未經正確校準、熒光滲漏未進行合理補償以及檢測區域（設門）未精確定位，則可能產生錯誤的檢測結果。請參考該儀器操作規程進行校準，確保儀器在使用前處于最佳檢測狀態。 4. 本品含熒光素，切勿直接接觸皮膚或沾染食物，操作時務必戴手套操作。 5. 標準品在配成溶液后，請在10小時內使用。 6. 在使用之前，捕獲微球混合液必須充分的振動混合。 7. 為確保熒光檢測質量，凡涉及檢測抗體的相關步驟都需避光操作。 8. 不同批號的試劑請勿混用，并請在有效期范圍內使用。
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| 1、抗體溶解方法 | |
| 2、抗體修復方式 | |
| 3、常用試劑的配制 | |
| 4、免疫組化操作步驟 | |
| 5、免疫組化問題解答 | |
| 6、Western Blotting 操作步驟 | |
| 7、Western Blotting 問題解答 | |
| 8、關于肽鏈的設計 | |
| 9、多肽的溶解與保存 | |
| 10、酶標抗體效價測定程序 | |
