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Human TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α Cytokine Kit (Flow Cytometry Multiplex Bead Assay) (MFH001)

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產品信息

產品編號

MFH001

英文名稱

Human TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α Cytokine Kit (Flow Cytometry Multiplex Bead Assay)

中文名稱

人十二項細胞因子檢測試劑盒（流式熒光發光法）

克隆號

性狀

Lyophilized or Liquid

保存條件

2～8℃，避光保存，有效期18個月。開瓶后避光2～8℃保存，可保存不超過30天。

注意事項

This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.

產品介紹

產品介紹

本試劑盒采用CBA多因子流式檢測技術，微球熒光編碼不同，不同微球群上包被TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α特異性抗體，與待測樣本孵育，可與樣本中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α特異性結合，之后加入生物素標記的檢測抗體，形成抗體包被微球-細胞因子-檢測抗體的免疫復合物；最后加入藻紅蛋白標記的鏈霉親和素，與生物素結合，通過流式細胞儀檢測，獲得待測物的熒光強度，熒光強度與樣本中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL- 6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α 的含量成正比，最后結合這十二種細胞因子標準品的標準曲線，從而實現對同一份樣本中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α的定量檢測。從而輔助判斷機體的免疫功能狀態。

預期用途

檢測人體血清血漿和培養上清中TNF-α/IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17/IFN-α的表達水平。

試劑盒組成

序號	試劑盒組成	組分	48 測試	96 測試
A	捕獲微球混合液	偶聯人TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4 、IL-5、IL-6 、IL-8 、IL- 10、IL-12p70 、IL-17 、IFN-α各抗體的微球	每個因子各0.25 ml	每個因子各0.5 ml
B	檢測抗體混合液	生物素化人TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2 、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-α檢測抗體	每個因子各0.5 ml	每個因子各1 ml
C	標準品	人TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-α 細胞因子重組蛋白凍干粉	1套	2 套
D	藻紅蛋白標記的鏈霉親和素	SAV-PE	5 mL	10 mL
E	標準品/樣品稀釋液	-	16 mL/瓶×1 瓶	16 mL/瓶×2 瓶
F	20×洗液	-	25 mL/瓶×1 瓶	25 mL/瓶×1 瓶
G	微孔板	-	96 孔/塊×1 塊	96 孔/塊×1 塊
H	封板膜	-	4 張	4 張

適用機型：本品適用于市面上的大多數有PE和APC通道的流式細胞儀。

樣本要求：

血清、血漿、細胞培養上清：建議4-6小時內檢測，如無法及時檢測請-20℃凍存，忌反復凍融。

檢驗方法

1. 洗液緩沖液（1×)的準備

顛倒混合標有20×洗液的瓶子。在475 mL蒸餾水中加入20×洗液25 mL，并輕輕混合以免起泡沫。儲存于2～8℃待用。

2. 標準品制備（準備8個1.5 mLEP管分別編號1.2.3.4.5.6.7.8 ）

2.1使用前按照下表將各因子的標準品用標準稀釋液溶解，充分混勻，室溫放置10分鐘，分別從每管中取出20 μl混合，此管將被用作標準品最高濃度1號管（5000pg/ml）。

標準品	數量（支）	含量/支	加入稀釋液體積( μ l）	濃度（pg/ml）
human TNF-α	1	1000pg	16.67	60000
human IFN-γ	1	1000pg	16.67	60000
human IL-2	1	1000pg	16.67	60000
human IL-4	1	1000pg	16.67	60000
human IL-6	1	1000pg	16.67	60000
human IL-5	1	1000pg	16.67	60000
human IL-10	1	1000pg	16.67	60000
human IL-12P70	1	1000pg	16.67	60000
human IL-1β	1	1000pg	16.67	60000
human IL-8	1	1000pg	16.67	60000
human IL-17	1	1000pg	16.67	60000
human IFN-α	1	1000pg	16.67	60000

2.2 其他7個（2～8號）EP管中分別加入150 μL標準品/樣品稀釋液，準備梯度稀釋標準品。

2.3 在1號管中轉移50μL標準品到2號管充分混勻，再在2號管轉移50 μL到3號管充分混勻。以同樣方式依次連續稀釋到7號管。

管號	上管標準品(μL)	標準品/樣品稀釋液(μL)	稀釋比例（對比1號）	濃度pg/mL
1	——	——	——	5000
2	50	150	1：4	1250
3	50	150	1：16	312. 5
4	50	150	1：64	78. 13
5	50	150	1：256	19. 53
6	50	150	1：1024	4.88
7	50	150	1：4096	1.22
8	——	150	——	0

3. 捕獲微球混合

確定實驗孔數（包括標準品和樣本），計算所需捕獲微球混合液的用量。例如：待測樣本88個，標準品8個,共計96孔。每個孔需要捕獲微球混合液50 μL。我們可以按100孔的量進行微球混合，每個因子相應的微球大約需取500 μL。（注意：需將捕獲微球渦旋20 s，充分混勻后再取）

4. 檢測抗體混合

確定實驗孔數（包括標準品和樣本），計算所需檢測的用量。例如：待測樣本88個，標準品8 個，共計96孔。每個孔需要檢測抗體100 μL。我們可以按100孔的量進行微球混合，每個因子相應的檢測抗體大約需取1000 μL。（注意：需將捕獲微球渦旋20 s，充分混勻后再取）

5. 樣本處理

建議對于血清或血漿樣本需使用標準品/樣品稀釋液進行2倍稀釋。

表1

樣本	稀釋比例 1:1	稀釋倍數
血清或血漿樣本	25 μL樣本+25μL標準品/樣品稀釋液	2

6. 操作步驟

*實驗前將所有試劑取出平衡至室溫；

*實驗過程中，包括清洗步驟，將板子始終水平放置，以免珠子丟失；

*孵育過程中，板子應注意避光。

6.1 從梯度稀釋好的標準品1-8號管中分別取出50 μL移入對應的96孔板孔中。

6.2 其余樣本孔每孔加入稀釋好的血清或血漿樣本50 μL。

6.3 渦旋微球30 s，每孔加入50 μL微球，現每孔體積應為100 μL/孔。（加微球過程中應隨時渦旋微球管，避免微球沉降，建議每加兩個孔，渦旋混勻一次微球）。

6.4 將96孔板放到搖床上450 rpm/min混勻2 min。

6.5 將96孔板卡放在37℃溫箱30 min。

6.6 將96孔板放在磁力板上吸附5 min，去除上清。

6.7 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入200 μL洗液。

6.8 再將96孔板放在磁力板上5 min，去除上清。

6.9 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100 μL檢測抗體。

6.10 37℃溫箱孵育30 min。

6.11 重復步驟5.6-5.8。

6.12 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100 μL藻紅蛋白標記的鏈霉親和素。

6.13 37℃溫箱孵育15 min。

6.14 重復步驟5.6-5.8。

6.15 每孔加入200 μL洗液重懸樣本，上流式細胞儀檢測。

7. 流式細胞儀檢測

7.1 微球群分布：

表2

特異性	微球位置	微球所屬區域
human TNF-α	L1	R1
human IFN-γ	L2	R1
human IL-2	L3	R1
human IL-4	L4	R1
human IL-6	L5	R1
human IL-5	L11	R1
human IL-10	L6	R2
human IL-12P70	L7	R2
human IL-1β	L8	R2
human IL-8	L9	R2
human IL-17	L10	R2
human IFN-α	L12	R2

注：微球內部用不同強度的熒光染料染色。

7.2 模板建立：

建立X軸為FSC、Y 軸為SSC的線性散點圖模板，設定混合微球位置，如說明書圖1；

建議兩個PE（X軸）和APC的對數散點圖模板，分別顯示R1門或R2門內微球，使得所有的微球群能夠清楚和明顯的分布于散點圖上，顯示各因子PE熒光強度。如說明書圖2，說明書圖3。調節PE PMT電壓，使所有微球群左側不壓線，右側位于PE軸檢測范圍內（說明書圖2,3）。

7.3 樣品的檢測結果分析

各標準品及樣本依次上機檢測，對于每種微球群，應最少獲取100個微球。利用標準品梯度作標曲，計算樣本檢測結果。

8. 軟件分析

用FCAP軟件進行分析

參考區間

用十項細胞因子檢測試劑盒(流式熒光發光法)檢測150例健康者，得到正常參考值：IL- 1β≤3.4 pg/mL、IL-2≤11.4 pg/mL、IL-4≤12.9 pg/mL、IL-6≤20. 1 pg/mL、IL-5≤8.57 pg/mL、IL-8≤15.71 pg/mL、IL-10≤5.9 pg/mL、IFN-γ≤15. 1 pg/ml、TNF-α≤6 . 1 pg/mL、IL- 12p70≤10. 18 pg/mL、IL- 17≤ 8.57 pg/mL、IFN-α≤6 . 1 pg/mL（由于環境、性別、年齡等差異，此數據僅供參考）。

檢測結果的解釋

1. 待檢測樣本細胞因子的測定在表3檢測范圍內，測定結果有效，可直接報告測定結果；若檢測結果超出檢測范圍,應用標準品/樣品/微球稀釋液將樣本稀釋適當的倍數重新檢測；若待測樣本的檢測結果低于檢測下限或未檢測到，則直接報告為≤最低檢測值。

表3

特異性	檢測范圍
human TNF-α	2 .44pg/mL-5000pg/mL
human IFN-γ	4 .88pg/mL-5000pg/mL
human IL-2	2 .44pg/mL-5000pg/mL
human IL-4	1 .22pg/mL-5000pg/mL
human IL-6	1 .22pg/mL-5000pg/mL
human IL-5	1 .22pg/mL-5000pg/mL
human IL-10	1 .22pg/mL-5000pg/mL
human IL-12P70	4 .88pg/mL-5000pg/mL
human IL-1β	9 .77pg/mL-5000pg/mL
human IL-8	2 .44pg/mL-5000pg/mL
human IL-17	4 .88pg/mL-5000pg/mL
human IFN-α	2 .44pg/mL-5000pg/mL

2. 建議：負責數據揭示和出具報告的實驗人員需經過正規的技術培訓。

檢驗方法的局限性

不合理的樣本采集、轉運、儲存、處理以及儀器的設置不當均有可能導致錯誤的檢測結果。

產品性能指標

1. 外觀和性狀

試劑盒各組份應齊全、完整，液體無滲漏；外包裝應完整、無破損，標簽應清晰、易識別。

2. 裝量

應符合要求，不低于標示值。

3. 準確度

使用本試劑盒檢測已知濃度的樣本，其檢測結果相對偏差在±15%以內。

4. 重復性

本試劑盒檢測TNF-α/IFN-γ/IL- 1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL- 10/IL- 12p70/IL-17/IFN-α變異系數（CV）應≤15%。

注意事項

1. 本試劑盒僅用于科研，不用于臨床診斷。

2. 實驗樣本、質控/標準品、實驗廢棄物等材料應當作為潛在傳染物進行處理，并且采用符合法規的預防措施對其處理。

3. 流式細胞儀未經正確校準、熒光滲漏未進行合理補償以及檢測區域（設門）未精確定位，則可能產生錯誤的檢測結果。請參考該儀器操作規程進行校準，確保儀器在使用前處于最佳檢測狀態。

4. 本品含熒光素，切勿直接接觸皮膚或沾染食物，操作時務必戴手套操作。

5. 標準品在配成溶液后，請在10小時內使用。

6. 在使用之前，捕獲微球混合液必須充分的振動混合。

7. 為確保熒光檢測質量，凡涉及檢測抗體的相關步驟都需避光操作。

8. 不同批號的試劑請勿混用，并請在有效期范圍內使用。

產品圖片

外觀及包裝

	1、抗體溶解方法
	2、抗體修復方式
	3、常用試劑的配制
	4、免疫組化操作步驟
	5、免疫組化問題解答
	6、Western Blotting 操作步驟
	7、Western Blotting 問題解答
	8、關于肽鏈的設計
	9、多肽的溶解與保存
	10、酶標抗體效價測定程序

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