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產品介紹

本試劑盒采用CBA多因子流式檢測技術，微球熒光編碼不同，不同微球群上包被mouse TNF-α/IFN-γ /IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1特異性抗體，與待測樣本孵育，可與樣本中mouse TNF-α/IFN-γ /IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1特異性結合，之后加入生物素標記的檢測抗體，形成抗體包被微球-細胞因子-檢測抗體的免疫復合物；最后加入藻紅蛋白標記的鏈霉親和素，與生物素結合，通過流式細胞儀檢測，獲得待測物的熒光強度，熒光強度與樣本中mouse TNF-α/IFN-γ /IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1的含量成正比，最后結合這六種細胞因子標準品的標準曲線，從而實現對同一份樣本中mouse TNF-α/IFN-γ /IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1的定量檢測。從而輔助判斷機體的免疫功能狀態。

預期用途

檢測小鼠生物標本中TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1的表達水平。

試劑盒組成

注：試劑盒中不包括，但試驗需要的材料：流式管，15 mL 離心管，1. 5 mL EP 管，錫箔紙，磁力板。

適用機型：

本品適用于BD公司的BD FACSCanto II、Beckman Navios 6/2和艾森公司的ACEA NovoCyte 等有PE、APC通道的流式細胞儀。

樣本要求：

血清：建議4-6小時內檢測，如無法及時檢測請-20℃凍存，忌反復凍融。

檢驗方法

1. 洗液（1×)的準備

顛倒混合標有20×洗液的瓶子。在475 mL蒸餾水中加入20×洗液25 mL，并輕輕混合以免起泡沫。儲存于2～8℃待用。

2. 標準品制備（準備7個1.5 mL EP管分別編號2.3.4.5.6.7.8 ）

2.1取出標準品凍干粉，每個因子用20 μL標準品/樣品稀釋液溶解，充分混勻，室溫放置10分鐘，將溶解后的六個因子轉移至1號管，并補80 μl標準品/樣品稀釋液，作為標準品最高濃度5000 pg/mL。

2.2 其他7個（2～8 號）EP管中分別加入150 μL標準品/樣品稀釋液，準備梯度稀釋標準品。

2.3 在1號管中轉移50 μL標準品到2號管充分混勻，再在2號管轉移50 μL到3號管充分混勻。以同樣方式依次連續稀釋到7號管。

3. 捕獲微球混合液處理

確定實驗孔數（包括標準品和樣本），計算所需捕獲微球混合液的用量。例如：待測樣本88個，標準品8個, 共計96孔。每個孔需要捕獲微球混合液50 μL。我們可以按100孔的量進行微球混合，需取5000 μL捕獲微球混合液。（注意：需將捕獲微球渦旋20 s，充分混勻后再取）

4. 樣本處理

建議對于血清或血漿樣本需使用標準品/樣品稀釋液進行2倍稀釋。

表1

5. 操作步驟

*實驗前將所有試劑取出平衡至室溫；

*實驗過程中，包括清洗步驟，將板子始終水平放置，以免珠子丟失；

*孵育過程中，板子應注意避光。

5.1 從梯度稀釋好的標準品1-8號管中分別取出50 μL移入對應的96孔板孔中。

5.2 其余樣本孔每孔加入稀釋好的血清或血漿樣本50 μL。

5.3 渦旋微球30 s，每孔加入50 μL微球，現每孔體積應為100 μL/孔。（加微球過程中應隨時渦旋微球管，避免微球沉降，建議每加8個孔，渦旋混勻一次微球）。

5.4 將96孔板放到搖床上450 rpm/min搖2min后，放入37℃溫箱，避光孵育30min。

5.5 將96孔板卡在磁力板上5min，去除上清。

5.6 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入200μL洗液。

5.7 重復步驟 5.5。

5.8 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100μL檢測抗體。

5.9 將96孔板放到搖床上450 rpm/min搖2min后，放入37℃溫箱，避光孵育30min。

5.10 重復步驟5.5-5.7。

5.11 將96孔板從磁力板上取下，每孔加入100μL藻紅蛋白標記的鏈霉親和素。

5.12 將96孔板放到搖床上450 rpm/min搖2min后，放入37℃溫箱，避光孵育15min。

5.13 重復步驟5.5-5.7。

5.14 每孔加入200μL洗液重懸樣本，上流式細胞儀檢測。

6. 流式細胞儀檢測

6.1 微球群分布 ：

表2

注 ：微球內部用不同強度的熒光染料染色。

6.2 模板建立：

建立X軸為FSC、Y 軸為SSC的線性散點圖模板，設定混合微球位置，如說明書圖1；

建議兩個PE（X軸）和APC的對數散點圖模板，分別顯示R1門或R2門內微球，使得所有的微球群能夠清楚和明顯的分布于散點圖上，顯示各因子PE熒光強度。如說明書圖2，說明書圖3。調節PE PMT電壓，使所有微球群左側不壓線，右側位于PE軸檢測范圍內（說明書圖2,3）。

6.3 樣品的檢測結果分析

各標準品及樣本依次上機檢測，對于每種微球群，應最少獲取100個微球。利用標準品梯度作標曲，計算樣本檢測結果。

檢測結果的解釋

1. 待檢測樣本細胞因子的測定在表3檢測范圍內，測定結果有效，可直接報告測定結果；若檢測結果超出檢測范圍,應用標準品/樣品/微球稀釋液將樣本稀釋適當的倍數重新檢測；若待測樣本的檢測結果低于檢測下限或未檢測到，則直接報告為≤最低檢測值。

表3

2. 建議：負責數據揭示和出具報告的實驗人員需經過正規的技術培訓。

檢驗方法的局限性

不合理的樣本采集、轉運、儲存、處理以及儀器的設置不當均有可能導致錯誤的檢測結果。

產品性能指標

1. 外觀和性狀

試劑盒各組份應齊全、完整，液體無滲漏；外包裝應完整、無破損，標簽應清晰、易識別。

2. 裝量

應符合要求，不低于標示值。

3. 準確度

使用本試劑盒檢測已知濃度的樣本，其檢測結果相對偏差在±15%以內。

4. 重復性

本試劑盒檢測TNF-α/IFN-γ/IL-6/IL-10/IL-12/MCP-1變異系數（CV）應≤15%。

注意事項

1. 實驗樣本、質控/標準品、實驗廢棄物等材料應當作為潛在傳染物進行處理，并且采用符合法規的預防措施對其處理。

2. 流式細胞儀未經正確校準、熒光滲漏未進行合理補償以及檢測區域（設門）未精確定位，則可能產生錯誤的檢測結果。請參考該儀器操作規程進行校準，確保儀器在使用前處于最佳檢測狀態。

3. 本品含熒光素，切勿直接接觸皮膚或沾染食物，操作時務必戴手套操作。

5. 標準品在配成溶液后，請在10小時內使用。

6. 在使用之前，捕獲微球混合液必須充分的振動混合。

7. 為確保熒光檢測質量，凡涉及檢測抗體的相關步驟都需避光操作。

不同批號的試劑請勿混用，并請在有效期范圍內使用。